人體細(xì)胞內(nèi)的鉀、鈉、氯等離子穩(wěn)態(tài)是受到嚴(yán)格調(diào)控的，離子穩(wěn)態(tài)一旦失衡，就會導(dǎo)致高血壓、抑郁、癲癇等一系列疾病。而在細(xì)胞膜上，有一類被稱為陽離子-氯離子共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白質(zhì)，可以帶著離子進(jìn)入和離開細(xì)胞，從而有效調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。不過長期以來，由于缺乏精確的結(jié)構(gòu)信息，人們對這類蛋白的工作機(jī)理還不甚了解。
近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭江濤課題組解析了這類蛋白質(zhì)中的一個成員——人源鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KCC1的2.9埃的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，揭示了鉀離子和氯離子的結(jié)合位點(diǎn)，提出一個鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理的模型，這將為相關(guān)的疾病治療和藥物設(shè)計(jì)提供新的視角。
10月25日，這項(xiàng)研究刊登在國際頂級雜志《科學(xué)》（Science）上。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉斯博士、冷凍電鏡中心常圣海博士和物理系碩士生韓斌銘為文章的共同第一作者。
圖1. 人源KCC1的結(jié)構(gòu)。（A）KCC1的二聚體結(jié)構(gòu)；（B）KCC1的鉀離子與氯離子結(jié)合位點(diǎn)。
為何霧里看花？
一般來說，人體細(xì)胞內(nèi)的鉀離子濃度是高于細(xì)胞外濃度的。鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白KCC利用這個鉀離子濃度梯度，將細(xì)胞內(nèi)的鉀離子和氯離子一起轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的氯離子濃度。
氯離子濃度是一個很關(guān)鍵的指標(biāo)。例如，在γ-氨基丁酸介導(dǎo)的抑制性神經(jīng)傳遞過程中，抑制性神經(jīng)元需要維持細(xì)胞內(nèi)較低的氯離子濃度才能發(fā)揮正常的抑制作用。正是由于鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一個成員KCC2不停地將細(xì)胞內(nèi)的鉀離子和氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，使得抑制性神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)能夠維持較低的氯離子濃度。如果KCC2發(fā)生突變，抑制性神經(jīng)傳遞就會受到破壞，這樣一來神經(jīng)元會持續(xù)放電，從而引發(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如癲癇等。
既然KCC的功能如此重要，為何科研人員長久以來都沒有揭開這個家族的面紗呢？
郭江濤研究員介紹說，這主要受限于兩方面的因素。首先，鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的樣品獲得不容易。要想做結(jié)構(gòu)研究，首先得有溶液狀態(tài)下的大量、均一的蛋白樣品。但因?yàn)殁?氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的本底含量很低，為了獲得大量的蛋白樣品，就需要將蛋白的基因包裹在桿狀病毒中，用桿狀病毒感染大量的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行過量表達(dá)。在蛋白純化過程中，由于鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是定位于細(xì)胞膜上的膜蛋白，具有很強(qiáng)的疏水性，在水溶液中膜蛋白不穩(wěn)定，易于沉淀，需要溶解在雙親性的去污劑中。因此，鉀-氯共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的純化和樣品制備的過程比一般的水溶性蛋白更加復(fù)雜和困難。蛋白純化過程就像是大浪淘沙，培養(yǎng)幾升的細(xì)胞，經(jīng)過逐步純化，最終才獲得100微克左右的蛋白樣品。
另一方面，較小分子量的膜蛋白的高分辨率結(jié)構(gòu)解析一直具有挑戰(zhàn)性。如果采用傳統(tǒng)的晶體學(xué)解析這種膜蛋白結(jié)構(gòu)，通常需要花費(fèi)幾年的時間，而且就算投入大量的人力和經(jīng)費(fèi)，最終結(jié)果也往往不理想。近年來冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展為解析膜蛋白結(jié)構(gòu)提供了便捷的途徑。不過，困難依舊存在。“冷凍電鏡通常對分子量大于150千道爾頓（道爾頓為相對原子質(zhì)量單位，1道爾頓的質(zhì)量等于1克的6.02×1023分之一）的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析非常有效，分辨率往往在3.5埃左右（1埃等于1米的一百億份之一）；但對于小分子量蛋白質(zhì)的高分辨率結(jié)構(gòu)解析仍然比較困難?！惫瓭f，以KCC1為例，最終解析結(jié)構(gòu)的部分的分子量只有120千道爾頓，分辨率為2.9埃，這對于一般的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究來說，是很不容易的。
飛越迷霧把你看清楚
劉斯經(jīng)過大量的蛋白表達(dá)和純化條件的優(yōu)化，最終獲得足夠量的可用于冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集的KCC1蛋白樣品。此時，浙江大學(xué)冷凍電鏡中心的300kv的高性能冷凍電鏡Titan Krios派上了大用場。
然而，有先進(jìn)的冷凍電鏡，也不一定拍出好照片。生物大分子樣品對曝光非常敏感，電子的輻射會讓其受損傷。拍照只能在曝光時間短、劑量低的情況下進(jìn)行，但這也直接導(dǎo)致了拍攝噪音大?！芭牡嚼硐氲恼掌婵芍^是一波三折，課題組的研究從2017年就開始了，但真正拿到高分辨結(jié)構(gòu)已經(jīng)是2019年初了?！背ＪズＵf。
為了減少電子對蛋白的輻射損傷，蛋白樣品需要在冷凍環(huán)境下進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。這又是個技術(shù)活。在數(shù)據(jù)收集前，科研人員用液態(tài)乙烷把蛋白溶液樣品快速冷凍在一張“銅網(wǎng)”上。銅網(wǎng)的每個目下面是一個方格，里面有幾百個通透的孔，蛋白顆粒就被玻璃態(tài)的冰層包裹在這些孔中。但是，問題又來了，一般的冰層厚度在100-200納米之間，而KCC1蛋白的直徑在8-10個納米之間，就好像要在十幾米深的泳池里尋找1米長的目標(biāo)，噪音很大。
為了提高分辨率，劉斯和常圣海先是“削薄”冰層，然后再不斷調(diào)整參數(shù)，讓冷凍后的KCC1蛋白顆粒能夠密集而均勻地分布在冰層較薄的區(qū)域。這樣不僅可以顯著降低冰層的噪音，提高分辨率，而且可以增加每張照片的蛋白顆粒數(shù)量，提高數(shù)據(jù)收集效率。
電鏡數(shù)據(jù)收集的過程，有點(diǎn)像電影的拍攝手法：在8秒的時間內(nèi)連續(xù)拍攝40張照片，形成一個“微電影”?？蒲腥藛T通過圖像處理，將微電影“疊加”成一張照片，這樣可以顯著提高照片的信噪比，獲得更為清晰的畫面。課題組從3000多部“微電影”中，挑出了一兩百萬個蛋白顆粒進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。經(jīng)過層層篩選，最終用十萬個左右的高質(zhì)量的蛋白顆粒進(jìn)行高分辨率三維重構(gòu)。
課題組最終獲得了兩套2.9埃高分辨率的KCC1的三維結(jié)構(gòu)。 “這項(xiàng)工作首先得益于近年來的冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展；劉斯和常圣海在蛋白樣品制備和數(shù)據(jù)收集處理方面的經(jīng)驗(yàn)和決心是課題取得進(jìn)展的關(guān)鍵因素?！惫瓭@樣評價道。
令人興奮的發(fā)現(xiàn)
分析了KCC1的高分辨率三維結(jié)構(gòu)后，研究人員發(fā)現(xiàn)KCC1是以二聚體的形式存在，它的跨膜區(qū)與胞外區(qū)均參與了二聚體的形成。在KCC1結(jié)構(gòu)中，研究人員鑒定出一個鉀離子和兩個氯離子的結(jié)合位點(diǎn)；結(jié)合離子轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)、分子動力學(xué)模擬、結(jié)構(gòu)比較等方法，該研究闡明了KCC1以1：1的比例同時同向轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子和氯離子的分子機(jī)理。
“闡明分子機(jī)理，不僅需要高分辨率三維結(jié)構(gòu)，而且需要離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性實(shí)驗(yàn)、分子動力學(xué)模擬進(jìn)行驗(yàn)證。范德比爾特大學(xué)的EricDelpire和浙大物理系的李敬源團(tuán)隊(duì)在這方面提供了專業(yè)的技術(shù)支持?！闭撐牡馁Y深作者葉升教授高度評價合作者的工作。
“物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸是人體細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換的重要途徑”，郭江濤介紹說，“在轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子和氯離子的過程中，KCC1就好像細(xì)胞膜上有一個旋轉(zhuǎn)門，朝內(nèi)這一側(cè)的門先打開，離子結(jié)合到KCC1上進(jìn)入旋轉(zhuǎn)門內(nèi)；然后朝外這一側(cè)的門打開了，離子從旋轉(zhuǎn)門釋放到細(xì)胞膜外?！?/span>
圖2. KCC1共轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子和氯離子的模型。第二個氯離子首先結(jié)合在第二位點(diǎn)，然后鉀離子和第一個氯離子結(jié)合；KCC1的構(gòu)象由內(nèi)向態(tài)向外向態(tài)轉(zhuǎn)變，鉀離子和第一個氯離子釋放至細(xì)胞外。
獲得了KCC1的高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)，將有助于下一步設(shè)計(jì)針對KCC的藥物，為治療癲癇等疾病提供幫助。文章審稿人認(rèn)為：“這項(xiàng)工作揭示了一個令人興奮的人源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)?！?
這項(xiàng)研究的主體工作在浙江大學(xué)完成，浙江大學(xué)冷凍電鏡中心為數(shù)據(jù)收集提供了大力支持。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的郭江濤研究員整合了德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心白曉辰團(tuán)隊(duì)、浙江大學(xué)葉升團(tuán)隊(duì)、范德比爾特大學(xué)的Eric Delpire團(tuán)隊(duì)以及浙江大學(xué)物理系的李敬源團(tuán)隊(duì)等研究力量，體現(xiàn)了跨學(xué)科合作的優(yōu)勢。該工作還得到了浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊巍教授、冷凍電鏡中心主任張興教授的幫助。該研究受到國家自然科學(xué)基金委、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://science.sciencemag.org/content/366/6464/505
（攝影 盧紹慶 圖片來源課題組）
