生長(zhǎng)素是最重要的植物激素，主要合成部位是芽、幼嫩的葉和發(fā)育中的種子，通過(guò)極性運(yùn)輸分配到植物各處組織，調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育——低濃度生長(zhǎng)素促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度生長(zhǎng)素抑制生長(zhǎng)。生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸對(duì)生長(zhǎng)素的分配至關(guān)重要。那么，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸是如何實(shí)現(xiàn)的呢？

近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物物理系長(zhǎng)聘副教授/附屬第四醫(yī)院雙聘教授郭江濤指導(dǎo)的浙江大學(xué)-湖北大學(xué)聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)闡明了生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN介導(dǎo)生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。這項(xiàng)工作于北京時(shí)間8月2日刊登在國(guó)際頂級(jí)期刊《自然》上。該成果作為植物生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸研究的重大突破，解決了植物向性這一個(gè)百年科學(xué)難題中的關(guān)鍵一環(huán)，為人們進(jìn)一步調(diào)控生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)於嘶A(chǔ)。

生長(zhǎng)素及其轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN的發(fā)現(xiàn)過(guò)程

19世紀(jì)末，英國(guó)著名生物學(xué)家、進(jìn)化論的奠基人達(dá)爾文在研究植物向性運(yùn)動(dòng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)植物胚芽鞘的尖端受單側(cè)光刺激后，向下面的伸長(zhǎng)區(qū)傳遞了某種“影響”，造成伸長(zhǎng)區(qū)背光面比向光面生長(zhǎng)快，胚芽鞘出現(xiàn)向光性彎曲（圖1）。這就是中學(xué)生物教科書(shū)上被大家廣為熟知的達(dá)爾文向光性實(shí)驗(yàn)。1928年，荷蘭科學(xué)家溫特證實(shí)胚芽鞘彎曲生長(zhǎng)是由一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)引起的，并命名為生長(zhǎng)素（auxin）。1946年，科學(xué)家從高等植物中首次分離出生長(zhǎng)素，其主要成分為吲哚乙酸IAA。 

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素不僅與植物向光性相關(guān)，還與植物向地性（向重力性）、向化性（包括向肥性）等相關(guān)。植物受單向的環(huán)境刺激而呈現(xiàn)的定向反應(yīng)統(tǒng)稱(chēng)為向性（tropism）。這種向性主要是由生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)極性分配造成的。因此，生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸在這一過(guò)程中就變得非常關(guān)鍵。 

達(dá)爾文植物向光性實(shí)驗(yàn)示意圖

生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸主要依賴(lài)于三種定位于細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白：AUX/LAX家族蛋白、PIN家族蛋白和ABCB家族蛋白，其中生長(zhǎng)素外排蛋白PIN起最主要作用。pin突變體通常表現(xiàn)出相應(yīng)組織生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸缺陷的表型，如向光性、向重力性受損等。然而，由于缺乏結(jié)構(gòu)信息，人們對(duì)PIN蛋白如何介導(dǎo)生長(zhǎng)素外排了解甚少。

PIN如何識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)素？

浙大研究團(tuán)隊(duì)利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，解析了擬南芥PIN3（AtPIN3）在未結(jié)合配體（AtPIN3apo）和結(jié)合IAA（AtPIN3IAA）兩種狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)。通過(guò)結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)AtPIN3以二聚體形式存在，每個(gè)亞基包含10個(gè)跨膜螺旋（TM1–10），TM1–5和TM6–10組成反向重復(fù)結(jié)構(gòu)（圖2a）。AtPIN3apo與AtPIN3IAA結(jié)構(gòu)類(lèi)似，且均為向內(nèi)開(kāi)放狀態(tài)。AtPIN3單體由支架結(jié)構(gòu)域（scaffold domain）和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（transport domain）組成。在A(yíng)tPIN3IAA結(jié)構(gòu)中，IAA結(jié)合在支架結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域之間的內(nèi)向開(kāi)放口袋中（圖2b），與多個(gè)保守的氨基酸發(fā)生氫鍵和疏水相互作用（圖2c） 

為了確定IAA與AtPIN3的結(jié)合模式，研究團(tuán)隊(duì)建立了體外放射性3H-IAA轉(zhuǎn)運(yùn)體系。相比于野生型AtPIN3，結(jié)合位點(diǎn)突變的3H-IAA外排活性顯著降低。同時(shí)通過(guò)表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)，測(cè)定野生型AtPIN3與突變體對(duì)IAA的解離常數(shù)（KD）。實(shí)驗(yàn)表明，野生型AtPIN3與突變體相比對(duì)IAA有更高的親和力。此外，本研究同時(shí)結(jié)合了分子動(dòng)力學(xué)模擬和結(jié)構(gòu)比較等方法對(duì)IAA的結(jié)合模式進(jìn)行多重驗(yàn)證，闡明了AtPIN3對(duì)IAA的識(shí)別與轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。 

 AtPIN3IAA結(jié)構(gòu)。a. AtPIN3IAA的密度圖和結(jié)構(gòu)圖。b. IAA的密度圖。

c. AtPIN3IAA結(jié)構(gòu)中IAA的結(jié)合位點(diǎn)。

NPA如何抑制生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸？

除草劑NPA（N-1-naphthylphthalamic acid）是一種被廣泛研究的生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸抑制劑。NPA處理的植株幾乎跟生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變體植株pin1的表型一模一樣。長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)NPA的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制一直存在爭(zhēng)議。

該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步解析了AtPIN3與抑制劑NPA復(fù)合物結(jié)構(gòu)（AtPIN3NPA）（圖3a，b）。研究人員同樣通過(guò)體外放射性3H-IAA轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)和表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NPA的結(jié)合位點(diǎn)。比較AtPIN3IAA和AtPIN3NPA發(fā)現(xiàn)，抑制劑NPA與底物IAA的結(jié)合位點(diǎn)重疊（圖3c）。因此，NPA為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，直接占據(jù)了PIN中生長(zhǎng)素的結(jié)合位點(diǎn)，抑制了轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中PIN的潛在構(gòu)象變化。

AtPIN3NPA結(jié)構(gòu)。a. AtPIN3NPA的密度圖。

b. NPA的密度圖。c. IAA與NPA結(jié)合位點(diǎn)疊合。

基于上述結(jié)構(gòu)和活性分析，研究團(tuán)隊(duì)提出了PIN介導(dǎo)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)和NPA抑制生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)姆肿訖C(jī)制。PIN處于內(nèi)向開(kāi)放狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的IAA結(jié)合在內(nèi)向開(kāi)放口袋中，引起PIN二體由內(nèi)向開(kāi)放狀態(tài)向外向開(kāi)放狀態(tài)轉(zhuǎn)換，IAA被釋放至細(xì)胞外（圖4）。抑制劑NPA結(jié)合在底物結(jié)合位點(diǎn)，阻礙了IAA的結(jié)合，同時(shí)抑制轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中PIN的潛在構(gòu)象變化，起到抑制生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)男Ч▓D4）。

AtPIN3轉(zhuǎn)運(yùn)IAA和NPA抑制AtPIN3的模型

該研究解析了3個(gè)AtPIN3高分辨率電鏡結(jié)構(gòu)，明確了底物IAA和抑制劑NPA與AtPIN3的結(jié)合模式。這項(xiàng)工作不僅闡明了人們長(zhǎng)久以來(lái)期待的PIN介導(dǎo)生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制，而且將有助于進(jìn)行作物改良，指導(dǎo)新型PIN抑制劑的開(kāi)發(fā)。這些抑制劑既可作為生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸機(jī)理研究的工具，也可作為農(nóng)業(yè)除草劑，具有廣泛的應(yīng)用前景。 

該工作是由浙江大學(xué)、湖北大學(xué)和天津大學(xué)的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成（圖5）。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院郭江濤組博士后蘇楠楠、楊帆組博士生竺愛(ài)琴和湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳姍組博士生陶鑫為論文的共同第一作者，郭江濤、吳姍和楊帆為共同通訊作者。參與這項(xiàng)工作的還有浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄭紹建教授和丁忠杰研究員、浙江大學(xué)冷凍電鏡中心常圣海老師、浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院郭逸蓉老師和張素芬老師、天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院葉升教授和湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院馬立新教授。

浙江大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)主要成員合影。前排左起：郭逸蓉、張素芬、張艷、蘇楠楠、竺愛(ài)琴、楊帆；

后排左起：周晨羽、葉繁、鄭紹建、郭江濤、常圣海。

（圖文由課題組提供）