多細胞生物中不同細胞類型共享相同的基因組，但由于基因的差異調(diào)控而形成高度特化的細胞功能。候選順式調(diào)控元件 (cCREs) 包括啟動子、增強子和絕緣子，通過提供轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的結(jié)合位點，在基因調(diào)控中起關(guān)鍵作用。通過解讀TFs及其相應cCREs在物種間的保守基因組調(diào)控模式，可以深入了解細胞類型演化。盡管已有工作通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA-seq，scRNA-seq）識別了多個物種的細胞特異TFs，但低表達水平的TFs的檢測仍受技術(shù)和成本限制，并且限制了TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的探索。單細胞染色質(zhì)可及性測序 （single cell ATAC-seq，scATAC-seq）可以提供與轉(zhuǎn)錄組互補的表觀調(diào)控信息，有助于我們更為深刻地理解跨物種的保守調(diào)控機制。人、小鼠的全身多組織染色質(zhì)可及性景觀已經(jīng)相繼問世，但其它模式生物如斑馬魚、果蠅和蚯蚓仍缺乏全身染色質(zhì)可及性景觀。

  2024年2月8日，浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院/良渚實驗室郭國驥教授團隊在Development Cell上在線發(fā)表了題為“Construction of Single-Cell Cross-Species Chromatin Accessibility Landscapes with combinatorial-hybridization-based ATAC-seq”的研究論文，開發(fā)了一種基于組合雜交的高通量、低成本、高信噪比的單細胞染色質(zhì)可及性測序技術(shù)CH-ATAC-seq，構(gòu)建了低等物種包括斑馬魚，果蠅，蚯蚓的全身染色質(zhì)可及性景觀，并闡述了跨物種基因和調(diào)控元件的保守和多樣性特征。

CH-ATAC-seq是一種基于組合雜交的單細胞染色質(zhì)可及性技術(shù)。首先，細胞核在4個96孔板內(nèi)經(jīng)過轉(zhuǎn)座反應打上第一輪共384種標簽。然后，細胞核被收集混勻并均勻分布到新的96孔板進行雜交反應，并引入第二輪共768種標簽。最后，細胞核再次收集并分布到96孔板進行PCR反應，引入最后一輪共384種標簽。理論上，單次實驗可以處理百萬級別的細胞核，并且多個樣本可以進行通過第一輪標簽進行標記后混到一起處理，大大減少了樣本間的批次效應（圖1）。本研究生成了基于CH-ATAC-seq平臺的小鼠數(shù)據(jù)，并與已發(fā)表的sci-ATAC-seq的小鼠腎臟數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CH-ATAC-seq具有明顯更高的轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）富集分數(shù)，表明CH-ATAC-seq數(shù)據(jù)具有更高的信噪比。

CH-ATAC-seq實驗原理流程

基于CH-ATAC-seq測序平臺，本研究構(gòu)建了成年斑馬魚、果蠅、蚯蚓的全身染色質(zhì)可及性景觀，總共得到~550000高質(zhì)量細胞核。為了驗證細胞類型注釋的準確性，利用相同物種的scRNA-seq數(shù)據(jù)進行標簽轉(zhuǎn)移。最后，分別對每個物種的差異peak富集，利用HOMER工具進行了motif的從頭富集。結(jié)果顯示，富集到的motif能較好地對應細胞類型特異功能。

為了系統(tǒng)性地進行跨物種細胞類型的比較分析，本研究收集了已發(fā)表的人、猴和小鼠的單細胞染色質(zhì)可及性景觀數(shù)據(jù)，并進行了上游的數(shù)據(jù)統(tǒng)一處理，最終得到了152種主要細胞類型以及約80萬個細胞類型特異的cCREs。隨后，以人的基因組為參考，基于liftOver工具，將小鼠和斑馬魚的peak進行分類，包括：序列水平上無法與人基因組的區(qū)域?qū)R的UA元件；可以對齊到人基因但并非在兩個物種都開放的A元件；以及既序列保守又在兩個物種中同時開放的CA元件。CA元件被認為是序列和功能同時物種間保守的調(diào)控元件，具有顯著更高的Phylop保守分數(shù)，并且這些元件高度富集在TSS區(qū)域。表明啟動子序列在細胞類型的進化中具有更高的選擇壓力，從而保留細胞類型特異的功能。 

隨后，基于SAMap算法，本研究對6個物種的染色質(zhì)可及性圖譜進行了跨物種分析，結(jié)果表明神經(jīng)和肌肉細胞展示了物種間高度保守性。另外，在細胞譜系水平上通過分析跨物種保守的TFs，發(fā)現(xiàn)上皮細胞顯示出了明顯的組織特異性。

最后，結(jié)合6個物種的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者利用SENIC+進行了調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)，鑒定出了譜系特異TF以及對應的TF靶向區(qū)域和TF靶向基因。與TF靶向區(qū)域相比，TF靶向基因具有相對高的保守程度。值得一提的是，雖然不同物種的TF靶向基因保守程度不高，但它們都能富集到細胞類型特異的功能。

總的來說，本研究開發(fā)了新一代的染色質(zhì)可及性技術(shù)——CH-ATAC-seq，并通過在物種層面上首次構(gòu)建跨物種染色質(zhì)可及性分析，深入了對細胞類型的保守性和多樣性的理解（圖2）。此外，本研究為遺傳學和進化生物學提供了寶貴數(shù)據(jù)資源和研究途徑。

分析流程圖

浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院博士生張國棟、博士生傅雨婷、博士生楊蕾、博士后葉昉和博士后張霈婧為本文共同第一作者。浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院/良渚實驗室郭國驥教授、良渚實驗室王晶晶研究員、浙江大學基礎(chǔ)醫(yī)學院韓曉平教授為本文的通訊作者。本研究獲得了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、國家創(chuàng)新團體計劃的支持。