核仁是多種液相凝聚物，存在液-液相分離（LLPS）現(xiàn)象，典型的核仁是一個三層區(qū)室化的結(jié)構(gòu)，許多蛋白都定位于此并參與構(gòu)建纖維中心（FC）、致密纖維組分（DFC）和顆粒組分（GC）液相分層。核仁相分離是核糖體生物發(fā)生，蛋白質(zhì)的翻譯和核仁應(yīng)激反應(yīng)所必需的至關(guān)重要的分子事件。然而，其在多能干細(xì)胞命運(yùn)決定過程中的作用尚不清楚。LIN28A是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，在促進(jìn)體細(xì)胞重編程和多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞質(zhì)中的LIN28A抑制let-7 microRNA的成熟在過去被廣泛研究，但很少有研究關(guān)注LIN28A在細(xì)胞核中的作用。

  2024年2月10日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)中心/浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院/良渚實(shí)驗(yàn)室張進(jìn)課題組，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院馮鈺課題組在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“Dynamic nucleolar phase separation influenced by non-canonical function of LIN28A instructs pluripotent stem cell fate Decisions”的研究論文，本研究利用多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)LIN28A可以作為一個核仁完整性的標(biāo)志蛋白，LIN28A的非經(jīng)典相分離功能可以調(diào)控重編程，和帕金森癥相關(guān)聯(lián)的LIN28A IDR突變對核仁相變有重要作用。該研究與張進(jìn)課題組在2021年7月31日Protein & Cell雜志上發(fā)表的題為“LIN28 Coordinately Promotes Nucleolar/Ribosomal Functions and Represses the 2C-like Transcriptional Program in Pluripotent Stem Cells”的研究論文以及2021年11月4日在Nature Communications雜志上發(fā)表題為“rRNA Biogenesis Regulates Mouse 2C-like State by 3D Structure Reorganization of Peri-Nucleolar Heterochromatin”的研究論文密切相關(guān),并進(jìn)一步從核仁應(yīng)激和相分離角度，對核仁參與調(diào)控多能干細(xì)胞的命運(yùn)決定的機(jī)制做出了更加深入的闡釋。

首先，研究人員構(gòu)建了eGFP-LIN28A敲入的小鼠胚胎干細(xì)胞E14細(xì)胞系和eGFP-LIN28A過表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞E14細(xì)胞系。觀察到LIN28A分布在細(xì)胞質(zhì)和核仁, LIN28A與核仁顆粒組分（GC）層的NPM蛋白共定位，并包裹致密纖維組分（DFC）層的蛋白FBL。這說明核仁中的LIN28A蛋白可以作為核仁的標(biāo)志物。同時，核仁中的LIN28A對相分離抑制劑1，6-己二醇（HEX）處理敏感， 1%HEX處理導(dǎo)致LIN28A凝集物在核仁內(nèi)的面積明顯擴(kuò)張彌散，單位面積內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著減弱,半徑形狀指數(shù)公式計(jì)算得到LIN28A形狀的不規(guī)則度也顯著增加（圖1）。

LIN28A在小鼠胚胎干細(xì)胞E14中的定位

在小鼠胚胎干細(xì)胞中，LIN28A的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）和內(nèi)在無序區(qū)（IDRs）是核仁相分離所必需的。LIN28A蛋白有五個主要結(jié)構(gòu)域:N端序列（氨基酸1-38），使用常用的內(nèi)在無序區(qū)評估網(wǎng)站PONDR（http://pondr.com/），預(yù)測N端序列為內(nèi)在無序的區(qū)域（IDR1）；一個冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）和一個鋅指結(jié)構(gòu)域（ZFD），這兩個結(jié)構(gòu)域已被證明可以結(jié)合RNA，是典型的RNA結(jié)合區(qū)域；CSD和ZFD之間的柔性連接區(qū)域（Linker，氨基酸113-136），被預(yù)測為內(nèi)在無序的區(qū)域，將其命名為IDR2；還有C端（氨基酸177-209）也被預(yù)測為無序區(qū)域，將其命名為IDR3。

為了確定LIN28A的單個結(jié)構(gòu)域?qū)巳室?/span>-液相分離的貢獻(xiàn)，研究人員構(gòu)建了N端，C端，N+C端，CSD（氨基酸39-112）和ZFD（氨基酸137-176）單結(jié)構(gòu)域缺失的截短體質(zhì)粒。接著利用CRISPR/CAS9技術(shù)得到Lin28a敲除小鼠胚胎干細(xì)胞E14的單克隆，而后在Lin28a敲除細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)FBL-mCherry或者NCL-eGFP融合蛋白，然后將對應(yīng)的與eGFP， mCherry融合的截短體LIN28A表達(dá)到已經(jīng)穩(wěn)定表達(dá)FBL-mCherry融合蛋白的Lin28a敲除細(xì)胞系中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lin28a敲除導(dǎo)致核仁被破壞，表現(xiàn)為FBL由野生型的環(huán)狀變?yōu)閺浬⒌臓顟B(tài)。過表達(dá)全長LIN28A可以挽救FBL形態(tài)異常，使FBL和NCL重新恢復(fù)環(huán)狀。LIN28A的 N端序列（IDR1）缺失，C端序列（IDR3）缺失或N，C兩端序列同時缺失的截短體并不能拯救LIN28A敲除導(dǎo)致的核仁損傷，FBL仍然表現(xiàn)為異常的彌漫狀態(tài)。CSD或ZFD的缺失嚴(yán)重破壞了LIN28A核仁定位和FBL環(huán)狀形態(tài)，且LIN28A和FBL在核仁中的共定位異常。簡而言之，當(dāng)LIN28A的IDR或RBD被截?cái)鄷r，DFC層核仁蛋白FBL失去了它的“環(huán)”結(jié)構(gòu)，這提示核仁相分離分層異常。對幾種截短體細(xì)胞系中核仁蛋白FBL典型形態(tài)進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)表明LIN28A的RNA結(jié)合區(qū)和內(nèi)在無序區(qū)是維持核仁正常相分離所必需的。

此外，研究人員檢測了FBL在以上幾種LIN28A細(xì)胞系中的流動性，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)全長LIN28A可以挽救Lin28a敲除導(dǎo)致的FBL流動性減弱的現(xiàn)象，而FBL在截短的LIN28A細(xì)胞系中都表現(xiàn)出相對較低的流動性。這一結(jié)果也從流動性的角度印證了LIN28A的RNA結(jié)合區(qū)和內(nèi)在無序區(qū)是維持核仁正常相分離所必需的。

接下來，在體外實(shí)驗(yàn)中，研究人員純化了全長和幾種截短體LIN28A重組蛋白，發(fā)現(xiàn)只有全長的LIN28A蛋白可以形成液滴，任何IDR和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的缺失都會消除LIN28A液-液相分離形成液滴的能力。LIN28A的N端序列缺失，CSD和ZFD之間的柔性連接區(qū)域缺失，C端序列缺失這三種IDR缺失情況會使蛋白形成不規(guī)則聚集體。

綜上所述，LIN28A的IDR和RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛纬?/span>LIN28A本身的相分離以及促進(jìn)核仁蛋白相分離至關(guān)重要（圖2）。

LIN28A的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和IDRs是核仁相分離所必需的

IDRs的關(guān)鍵氨基酸對LIN28A和核仁相分離至關(guān)重要。上述的實(shí)驗(yàn)證明了RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和內(nèi)在無序區(qū)對LIN28A和核仁的相分離至關(guān)重要。可以發(fā)生液-液相分離的蛋白的特點(diǎn)是IDR序列的存在。IDR區(qū)域富含少數(shù)氨基酸的重復(fù)序列，通常是低復(fù)雜度的區(qū)域,不折疊成一個固定的三維結(jié)構(gòu)。RNA結(jié)合域已經(jīng)在LIN28A功能的背景下進(jìn)行了深入研究。作者更好奇IDR區(qū)域的功能,這是以前在LIN28A的研究中沒有被關(guān)注到的。接下來，研究人員進(jìn)一步將研究范圍精確到到賦予IDR相分離特性所必需的關(guān)鍵氨基酸?？杀涣姿峄?/span>S120, S200絲氨酸殘基，以及與帕金森病相關(guān)的R192精氨酸殘基，三者都在LIN28A的IDR區(qū)域中，并且這三個氨基酸在人和小鼠之間保守。一些研究表明，絲氨酸磷酸化和精氨酸通過改變蛋白所帶電荷影響相分離。為了進(jìn)一步了解這些氨基酸在LIN28A相分離中的作用，用丙氨酸取代絲氨酸，構(gòu)建了模擬去磷酸化的 S120A和S200A雙氨基酸突變的LIN28A突變體，命名為Mut LIN28A，并將該突變體穩(wěn)定表達(dá)于Lin28a敲除的E14細(xì)胞系。FRAP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mut LIN28A在核仁內(nèi)的流動性減弱，并且導(dǎo)致核仁蛋白FBL流動性減弱。

而后，研究人員分別構(gòu)建了模擬去磷酸化S120A LIN28A單個氨基酸突變體和模擬去磷酸化S200A LIN28A單個氨基酸突變體。FRAP分析顯示，兩個模擬去磷酸化的單個氨基酸突變體LIN28A蛋白都表現(xiàn)出較低的流動性，同時FBL在核仁中的流動性較低。

最近,功能喪失突變體R192G LIN28A在兩個早發(fā)性帕金森病的病人中被發(fā)現(xiàn),據(jù)報(bào)道，野生型LIN28A過表達(dá)可促進(jìn)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在帕金森病模型中的治療潛力，但在相分離領(lǐng)域里沒有已知的機(jī)制解析突變導(dǎo)致的發(fā)育缺陷和中腦多巴胺神經(jīng)元相關(guān)表型。FRAP分析顯示，R192G單突變的LIN28A蛋白在核仁中的流動性較低，FBL蛋白也是如此。所有突變體在細(xì)胞質(zhì)中的流動性不受影響。

為了進(jìn)一步確認(rèn)LIN28A突變體對核仁破壞作用是由于其相分離特性減弱所致，通過融合外源的FUS IDR (S120A-FUS IDR, S200A-FUS IDR, R192G-FUS IDR)來構(gòu)建挽救性的LIN28A突變體， FUS IDR被公認(rèn)可以驅(qū)動相分離。值得注意的是，融合的IDR恢復(fù)了LIN28A突變體的形態(tài)和相分離能力。

綜上所述，IDR區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸對于LIN28A相分離以及維持正常的核仁相分離是必需的（圖3）。

IDRs的關(guān)鍵氨基酸對LIN28A和核仁相分離至關(guān)重要

LIN28A維持的核仁相分離對小鼠胚胎干細(xì)胞從naive到primed多能性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。與在LIF/2i培養(yǎng)條件中相比，FGF2/Activin A培養(yǎng)基培養(yǎng)的野生型mESCs表達(dá)較高的primed狀態(tài)標(biāo)志基因Otx2，Fgf5和Lin28a，較低的na?ve狀態(tài)標(biāo)記基因Klf4、Nanog和Esrrb。在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Lin28a敲除的mESCs，相對于野生型mESCs，表現(xiàn)出na?ve狀態(tài)相關(guān)基因Nanog，Klf4的持續(xù)高水平表達(dá)。在Lin28a敲除細(xì)胞中過表達(dá)全長野生型(WT) LIN28A時，FGF2/Activin A培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞恢復(fù)了向primed狀態(tài)轉(zhuǎn)換的能力。這說明LIN28A可以促進(jìn)mESCs從naive到primed多能性轉(zhuǎn)化。

在Lin28a敲除細(xì)胞中過表達(dá)磷酸化缺失的LIN28A突變體(Mut LIN28A)時，NANOG免疫染色和熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)分析顯示Mut LIN28A突變體細(xì)胞在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中Nanog基因仍然持續(xù)高水平表達(dá)，傾向于維持na?ve狀態(tài)。磷酸化缺失的LIN28A (S120A和S200A)不能促進(jìn)ESC從na?ve狀態(tài)退出，進(jìn)入primed狀態(tài)。S120A, S200A和R192G三個單氨基酸突變體LIN28A也都失去了促進(jìn)mESCs從na?ve狀態(tài)退出，進(jìn)入primed的功能，但是三種突變體與FUS IDR融合后，在FGF2/Activin A培養(yǎng)基中NANOG熒光減弱，mESCs可以順利的進(jìn)入primed狀態(tài)。以上結(jié)果表明，LIN28A相分離對小鼠胚胎干細(xì)胞從naive到primed多能性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

STED超高分辨率成像顯示，FBL在primed狀態(tài)的野生型mESCs中形成了較大的典型的“環(huán)”結(jié)構(gòu)，表明primed狀態(tài)下的DFC單元更發(fā)達(dá)。LIN28A的缺失會導(dǎo)致FBL環(huán)狀結(jié)構(gòu)不明顯，NPM形態(tài)異常，FBL不能浸潤在NPM的小孔中，核仁分層紊亂。這種異常的FBL形態(tài)和核仁分層在從naive狀態(tài)到primed狀態(tài)的轉(zhuǎn)換過程中沒有改善。以上結(jié)果說明從naive狀態(tài)到primed狀態(tài)的轉(zhuǎn)換過程中，LIN28A幫助核仁正確分層，維持核仁正常相分離。

綜上所述，在na?ve多能性狀態(tài)向primed多能性狀態(tài)轉(zhuǎn)換期間，核仁的形態(tài)和功能變得更加成熟。LIN28A介導(dǎo)的相分離在核仁重構(gòu)過程和隨后的細(xì)胞命運(yùn)的決定中發(fā)揮重要作用（圖4）。

LIN28A維持的核仁相分離對小鼠胚胎干細(xì)胞從naive到primed多能性轉(zhuǎn)化至關(guān)重要

LIN28A相分離對體細(xì)胞重編程至關(guān)重要。因此，研究人員想知道LIN28A在核仁中的相分離是否會影響重編程的效率。在小鼠體細(xì)胞重編程實(shí)驗(yàn)中，LIN28A IDR區(qū)單個氨基酸突變導(dǎo)致重編程效率降低。FUS IDR融合后的LIN28A突變體挽救了降低的重編程效率，其具備與野生型相似的重編程效率。

作者進(jìn)一步鑒定了小鼠的MEF細(xì)胞和iPSCs的核仁狀態(tài)，STED成像顯示MEF細(xì)胞和小鼠iPSCs之間核仁的形態(tài)和分層存在顯著差異。在MEF細(xì)胞中，NPM呈不規(guī)則形狀;而在iPSCs中，NPM呈圓形帶小孔的“蓮藕”結(jié)構(gòu)，并與LIN28A共定位。使用半徑指數(shù)公式 (Boyce-Clark semidiameter index)來量化GC層形狀的規(guī)律性。與MEF細(xì)胞相比，在iPSCs中，GC層形態(tài)顯示更高程度的規(guī)則性。

綜上所述，在小鼠體細(xì)胞重編程的研究背景下， IDR區(qū)域介導(dǎo)的LIN28A相分離對小鼠體細(xì)胞重編程過程中的核仁重塑至關(guān)重要，并關(guān)系著重編程的效率。重編程的過程也是核仁分層變得清晰的過程（圖5）。

LIN28A相分離對體細(xì)胞重編程至關(guān)重要

綜上所述，該研究明確了LIN28A幫助完善核仁分層，這在小鼠胚胎干細(xì)胞從naive到primed多能性轉(zhuǎn)化過程中起到促進(jìn)作用；以及在重編程體系中LIN28A相分離對核仁重塑，進(jìn)而促進(jìn)重編程的作用（圖6）。

LIN28A相分離在維持核仁完整性和決定細(xì)胞命運(yùn)中的作用模型

浙江大學(xué)張進(jìn)教授和馮鈺教授為本文的通訊作者。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士生譚田雨為本文的第一作者，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士生高波為本文提供大力幫助。本課題的研究得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目、浙江省杰出青年基金項(xiàng)目以及浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目的支持，同時還得到了浙江大學(xué)尹亞飛課題組，浙江大學(xué)錢鵬旭課題組，北京大學(xué)季雄課題組，哈佛醫(yī)學(xué)院George Daley課題組等國內(nèi)外單位的支持。