腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system; ENS）是神經(jīng)元胞體位于腸內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)，可獨立于大腦發(fā)揮作用，被稱為人體“第二大腦”，即“腸腦”。人體ENS由約5億個神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元與腸內(nèi)免疫細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、血管及平滑肌相互作用以維持腸道功能。同時，ENS也通過周圍神經(jīng)（內(nèi)臟感覺、交感和副交感神經(jīng)）同大腦聯(lián)系，形成腦-腸軸雙向神經(jīng)傳導(dǎo)通路。最近研究發(fā)現(xiàn)ENS與腸內(nèi)菌群互動參與帕金森氏病、自閉癥和抑郁癥等精神疾病發(fā)生與發(fā)展。確定ENS胚胎學(xué)來源并揭示其發(fā)育調(diào)控機制有助于了解ENS功能并為ENS相關(guān)腸道和精神疾病的機制研究提供理論支持。

ENS來源于神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells; NCCs）。NCCs為一群產(chǎn)生于神經(jīng)管背側(cè)多潛能細(xì)胞，依據(jù)其形成神經(jīng)管位置分為四個亞群，每一亞群可遷移至身體不同位置形成不同類型細(xì)胞（圖 1）。現(xiàn)今領(lǐng)域內(nèi)對于ENS胚胎學(xué)來源的共識是：迷走神經(jīng)嵴細(xì)胞（vNCCs）進入食管后沿腸道由近側(cè)端向遠側(cè)端遷移形成絕大部分ENS，骶神經(jīng)嵴細(xì)胞（sNCCs）自骶部神經(jīng)管遷移進入末端結(jié)腸后由遠側(cè)端向近側(cè)端遷移對結(jié)腸ENS有所貢獻（圖1）。先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung’s disease; HD）是一種臨床常見新生兒疾病，發(fā)病率為1/2000～1/5000，病理特點為vNCCs沿腸道遷移障礙導(dǎo)致的遠端腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失（圖1）。sNCCs對ENS貢獻理論無法解釋HD病理特點，因而對人們理解HD發(fā)病機制造成極大困擾。同時，斑馬魚的研究結(jié)果揭示sNCCs對ENS沒有貢獻，人體sNCCs對ENS貢獻的證據(jù)也是缺乏。因此，提供可信實驗證據(jù)以確定sNCCs對ENS貢獻與否極為必要。

圖1 課題背景：左圖修改自Nature Reviews Neuroscience 2007,8:466-479，中圖和右圖由王良課題組提供 

2024年3月5日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖和組織胚胎學(xué)系、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、雙腦中心王良課題組聯(lián)合德國亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院Till Marquardt課題組，在消化領(lǐng)域國際重要期刊Gastroenterology上發(fā)表了題為“Sacral neural crest-independent origin of the enteric nervous system in mouse”的最新研究成果。該項研究通過構(gòu)建基因編輯小鼠對vNCCs和sNCCs進行譜系追蹤，結(jié)合三維重建和體外共培養(yǎng)等研究方法，揭示sNCCs對ENS沒有貢獻。研究成果理清了關(guān)于ENS胚胎學(xué)來源的爭議，為理解ENS發(fā)育機制及ENS相關(guān)疾病發(fā)病機制奠定了一定理論基礎(chǔ)。

 sNCCs對ENS有所貢獻的實驗證據(jù)來自三方面：

1）通過在早期雞和小鼠胚胎的神經(jīng)管內(nèi)注射示蹤劑標(biāo)記sNCCs后，在經(jīng)過體外培養(yǎng)的胚胎的腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞。但是該實驗方法存在特異性差的缺陷，即示蹤劑可能同時標(biāo)記神經(jīng)管內(nèi)外的非sNCCs細(xì)胞；2）利用NCC標(biāo)記物進行免疫染色發(fā)現(xiàn)結(jié)腸內(nèi)存在非vNCCs細(xì)胞。同樣該實驗方法無法證明這些細(xì)胞來自骶神經(jīng)管；3）通過雞-鵪鶉神經(jīng)管移植實驗或者小鼠盆腔神經(jīng)節(jié)結(jié)腸共培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)存在sNCCs。由于這些實驗操作改變了sNCCs正常的體內(nèi)遷移環(huán)境，因此極有可能改變了sNCCs遷移特性。為了彌補上述實驗方法缺陷，研究人員首先利用sNCCs的遷移特點及Wnt1基因的表達特點，構(gòu)建Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠對sNCCs進行譜系追蹤發(fā)現(xiàn)sNCCs沒有遷移進入腸道，得出sNCCs對ENS沒有貢獻的初步結(jié)論。隨后，科研人員構(gòu)建了針對vNCCs的Sox10^CreERT2；Phox2b^FLP；Ai65譜系追蹤小鼠，并將此小鼠同Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠交配進一步構(gòu)建Wnt1^DreERT2；Phox2b^FLP；Sox10^CreERT2；H11^RSRYFP；Ai65，即WPS小鼠。WPS孕鼠接受Tamoxifen注射后，胚胎體內(nèi)sNCCs通過Dre-Rox基因重組被YFP標(biāo)記，vNCCs通過FLP-FRT和Cre-loxp基因雙重組被TOM標(biāo)記，進而實現(xiàn)對sNCCs和vNCCs同時標(biāo)記。WPS小鼠譜系追蹤結(jié)果表明，sNCCs沒有遷移進入腸道，vNCCs為ENS唯一胚胎學(xué)來源（圖2）。

圖2 sNCCs對ENS沒有貢獻

綜上，該項研究成果通過修正ENS發(fā)育模式（圖3），理清半個多世紀(jì)來關(guān)于ENS胚胎學(xué)來源的爭議，在完善ENS發(fā)育理論同時也為理解先天性巨結(jié)腸發(fā)病機制提供了新的洞見。同時，由于一些課題組已經(jīng)開始探索以sNCCs為靶細(xì)胞的先天性巨結(jié)腸治療策略，研究成果將有助于鎖定vNCCs為ENS發(fā)育缺陷疾病的治療靶標(biāo)細(xì)胞，因而對ENS發(fā)育缺陷疾病的治療具有一定指導(dǎo)作用。

圖3 腸神經(jīng)胚胎學(xué)來源發(fā)育模式修正圖

王良課題組余琦博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院博士后）、劉莉博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院博士后）、杜夢潔博士（現(xiàn)為浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院病理科主管技師）為本文共同第一作者。浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王良長聘副教授主導(dǎo)了這項研究，為論文最后通訊作者。德國亞琛工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院Till Marquardt教授為論文共同通訊作者。本研究獲得國家自然科學(xué)基金面上項目和浙江省自然科學(xué)基金重點項目資助。王良課題組博士生辛?xí)札埡皖櫰G蘭及Till Marquardt課題組Daniel Muller博士參與課題并作出一定貢獻。該項工作獲得浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院谷巖教授、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院高志剛主任醫(yī)師及復(fù)旦大學(xué)腦科學(xué)研究院何苗研究員的大力支持。課題組感謝浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺方三華老師提供的技術(shù)支持及上海南方模式生物有限公司協(xié)助制備基因編輯小鼠。

王良，浙江大學(xué)長聘副教授，博士生導(dǎo)師，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院和浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院雙聘教授，系統(tǒng)醫(yī)學(xué)中心和雙腦中心獨立研究員。課題組研究方向為周圍神經(jīng)，重點關(guān)注內(nèi)臟神經(jīng)（內(nèi)臟感覺、交感和副交感神經(jīng)）、腸神經(jīng)和內(nèi)臟施旺細(xì)胞的發(fā)育機制及相關(guān)疾病發(fā)病機制，長期目標(biāo)為周圍神經(jīng)疾病的臨床治療提供相關(guān)的理論指導(dǎo)。近年來作為最后通訊作者在Gastroenterology、CMGH和Journal of Neuroscience雜志上發(fā)表多篇論文。王良課題組長期歡迎研究生報考和博士后應(yīng)聘，歡迎有醫(yī)學(xué)和生物學(xué)背景且對周圍神經(jīng)發(fā)育具有濃厚興趣的人員聯(lián)系咨詢，有意向可發(fā)送簡歷至lwang1@zju.edu.cn。