PARP抑制劑利用合成致死（Synthetic Lethality）效應(yīng)殺死攜帶BRCA1/2（Breast cancer susceptibility gene）缺陷的腫瘤細(xì)胞具有重要的臨床意義。然而，一部分腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)恢復(fù)同源重組修復(fù)或通過(guò)重建復(fù)制叉穩(wěn)定性等機(jī)制，對(duì)PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥。由于學(xué)術(shù)界對(duì)復(fù)制叉穩(wěn)定性維持機(jī)制的研究尚淺，因此，目前對(duì)BRCA1/2缺陷腫瘤細(xì)胞如何通過(guò)重建復(fù)制叉穩(wěn)定性獲得PARP抑制劑耐藥性的分子機(jī)制也知之甚少。
2024年4月22日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉婷課題組在《Nature Chemical Biology》雜志在線發(fā)表題為“UFL1 triggers replication fork degradation by MRE11 in BRCA1/2-deficient cells”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)制壓力下，E3連接酶UFL1催化PTIP蛋白發(fā)生UFMylation修飾，進(jìn)而促進(jìn)BRCA1/2缺陷細(xì)胞中新生DNA鏈的降解。這一分子機(jī)制表明，BRCA1/2缺陷細(xì)胞可以通過(guò)失活UFMylation通路來(lái)重建復(fù)制叉穩(wěn)定性，從而對(duì)PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥。這也是國(guó)際上首次報(bào)道UFMylation參與復(fù)制叉穩(wěn)定性維持的功能與分子機(jī)制。
復(fù)制壓力發(fā)生時(shí)，解旋酶與聚合酶發(fā)生解偶聯(lián)或受到核酸酶修剪，導(dǎo)致停滯的復(fù)制叉暴露出單鏈DNA（ssDNA），并與單鏈結(jié)合蛋白R(shí)PA復(fù)合體結(jié)合。隨后，重組酶RAD51置換RPA，形成ssDNA-RAD51復(fù)合物。接著，在轉(zhuǎn)位酶（Translocase）如SMARCAL1、ZRANB3、HLTF和PICH，以及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶TOP2A和SUMO E3連接酶ZATT等的協(xié)作催化下，新生子鏈DNA經(jīng)過(guò)兩步翻轉(zhuǎn)并退火。此時(shí)，復(fù)制叉形成四叉的霍利迪交叉（Holliday Junction）結(jié)構(gòu)，從而暫時(shí)穩(wěn)定了停滯復(fù)制叉。該過(guò)程中，RAD51促進(jìn)復(fù)制叉翻轉(zhuǎn)的過(guò)程，與解旋酶BLM所推動(dòng)的復(fù)制叉重啟相拮抗。劉婷課題組于2024年2月在《Nature Communications》上發(fā)表的研究論文報(bào)道了TFIP11蛋白結(jié)合到停滯復(fù)制叉上，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制BLM與復(fù)制叉的結(jié)合，促使RAD51與復(fù)制叉結(jié)合，并促進(jìn)復(fù)制叉翻轉(zhuǎn)的分子生物學(xué)機(jī)制。此外，為了維持復(fù)制的穩(wěn)定性，停滯復(fù)制叉必須防止核酸內(nèi)切酶SLX4復(fù)合物被過(guò)度招募其上，切割復(fù)制叉并導(dǎo)致復(fù)制叉崩塌。劉婷課題組于2024年4月在《The EMBO Journal》上發(fā)表的研究論文報(bào)道了ssDNA-RPA復(fù)合物所招募的ATR激酶如何阻止SLX4核酸酶復(fù)合體的過(guò)度募集，從而避免復(fù)制叉崩塌的分子機(jī)制。
BRCA1/2蛋白在復(fù)制叉穩(wěn)定性維持中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。當(dāng)翻轉(zhuǎn)發(fā)生時(shí)，重組酶RAD51與翻轉(zhuǎn)鏈的結(jié)合需要被BRCA1/2穩(wěn)定，以保護(hù)新生DNA鏈免受MRE11等核酸酶的降解。在BRCA1/2缺陷的腫瘤細(xì)胞中，由于復(fù)制叉無(wú)法維持其穩(wěn)定性，這些細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑表現(xiàn)出高度敏感，導(dǎo)致合成致死。
UFMylation是一種類泛素化修飾，其修飾遵循與泛素化修飾相似的E1-E2-E3級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程，將類泛素蛋白UFM1(Ubiquitin-fold modifier 1)共價(jià)連接到底物蛋白的賴氨酸殘基(K)上，其中UFL1(UFMylation E3-like ligase 1)是目前唯一已知的E3連接酶。自2004年發(fā)現(xiàn)UFMylation以來(lái)，盡管這一翻譯后修飾已被證明在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和基因組完整性等方面具有重要意義，但迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的UFMylation底物十分有限，尚未有UFMylation參與復(fù)制叉穩(wěn)定性調(diào)控的報(bào)道。
劉婷課題組在本研究中發(fā)現(xiàn)，在BRCA1/2缺陷的細(xì)胞中，當(dāng)UFMylation的E3連接酶UFL1被敲減時(shí)，部分恢復(fù)了由PARP抑制劑所引起的基因組不穩(wěn)定性，并證明該表型的出現(xiàn)并非由于同源重組修復(fù)被重建，而是由于在復(fù)制壓力下，新生DNA鏈不再受到降解。進(jìn)一步的研究表明，在BRCA1/2缺陷的細(xì)胞內(nèi)，UFL1催化核酸酶MRE11的關(guān)鍵招募蛋白PTIP發(fā)生第148位賴氨酸（K148）的UFMylation修飾。而PTIP蛋白的UFMylation修飾則進(jìn)一步促進(jìn)了PTIP- MLL3/4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體的組裝，進(jìn)而使得停滯復(fù)制叉處組蛋白H3K4的甲基化水平顯著增加。核酸酶MRE11隨后響應(yīng)該甲基化信號(hào)，被招募到停滯復(fù)制叉上，降解新生DNA。
圖1工作模式圖
綜上所述，本文首次報(bào)道了UFMylation參與調(diào)節(jié)復(fù)制叉穩(wěn)定性的功能與機(jī)制，系統(tǒng)闡明了UFMylation促進(jìn)BRCA1/2缺陷細(xì)胞中新生DNA鏈在復(fù)制壓力下發(fā)生降解的分子生物學(xué)過(guò)程，并深入揭示了當(dāng)UFL1缺失時(shí)，核酸酶MRE11無(wú)法降解新生DNA鏈，從而重建復(fù)制叉穩(wěn)定性，使細(xì)胞對(duì)PARP抑制劑產(chǎn)生耐藥性的分子機(jī)制。
該項(xiàng)工作主要由浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院劉婷課題組研究助理田甜完成，田甜為論文的第一作者，劉婷教授為該論文的通訊作者。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、國(guó)家科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目資助。
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