2024年5月22日，浙江大學生命科學研究院/動物科學學院朱永群課題組、生命科學學院周艷課題組和北京大學劉小云課題組聯(lián)合在Nature上發(fā)表了題為“Legionella effector LnaB is a phosphoryl-AMPylase that impairs phosphosignalling”的文章，發(fā)現(xiàn)了一類廣泛存在于病原菌中新型的LnaB家族磷酰基單磷酸腺苷酸化酶效應(yīng)蛋白，揭示了全新的磷?；佘账峄揎椇驼{(diào)節(jié)磷酸化信號轉(zhuǎn)導的方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內(nèi)不可被進一步共價修飾的傳統(tǒng)概念。該工作還闡釋了病原菌通過同一效應(yīng)蛋白既保護宿主經(jīng)典泛素通路，又抑制宿主免疫防御反應(yīng)，以達到與宿主細胞短期共存的目的，實現(xiàn)了“綿里藏針”的致病策略。
單磷酸腺苷酸化修飾（AMPylation）是一種最早發(fā)現(xiàn)于1967年、廣泛存在于原核生物和真核生物中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、神經(jīng)退行性疾病、適應(yīng)性免疫等過程中發(fā)揮著重要作用。以往的研究發(fā)現(xiàn)，該修飾主要由Fic等家族單磷酸腺苷酸化酶（AMPylase）催化，將單磷酸腺苷酸（AMP）基團轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，之前鑒定出的單磷酸腺苷酸化修飾位點均發(fā)生在蛋白底物的蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸等殘基上。
嗜肺軍團菌是導致人類軍團病的致病菌，其感染肺巨噬細胞，在宿主細胞內(nèi)形成獨特的膜泡結(jié)構(gòu)，從而生存和繁殖。2016年羅招慶、Ivan Dikic、Ralph Isberg和茅毓新等多個實驗室先后發(fā)現(xiàn)，嗜肺軍團菌利用SidE家族效應(yīng)蛋白催化不依賴E1和E2的非典型泛素化過程，通過對泛素（Ub）第42位精氨酸殘基進行ADP-核糖基化修飾（ADPRR42 -Ub）的中間步驟，最終將泛素以磷酸核糖基（P-ribose）共價連接到相關(guān)底物蛋白質(zhì)的絲氨酸殘基上，促進嗜肺軍團菌膜泡的成熟，該非典型泛素化過程及其隨后的效應(yīng)蛋白DupA/B的作用，產(chǎn)生了磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）。 磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）對宿主具有細胞毒性，說明可能需要特殊的效應(yīng)蛋白消除這些毒性泛素分子、或者對泛素進行其他修飾，才能有利于該菌在宿主細胞內(nèi)生存、達到與宿主細胞短期的共存。
為了驗證嗜肺軍團菌是否存在特殊的效應(yīng)蛋白消除PRR42-Ub、或者對泛素進行其他修飾，該研究建立了獨特體外和體內(nèi)篩選體系，發(fā)現(xiàn)其效應(yīng)蛋白LnaB是一個獨特的AMPylase（腺苷酸化酶），以ATP作為配體，以宿主肌動蛋白（actin）作為激活劑，對PRR42-Ub的磷?；呋瘑瘟姿嵯佘账峄ˋMPylation）修飾，從而生成ADPRR42-Ub。生成的ADPRR42-Ub進一步由效應(yīng)蛋白MavL水解成為Ub。這個由LnaB和MavL催化形成的級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)了對非經(jīng)典泛素化過程的逆轉(zhuǎn)（圖2），從而保護了對嗜肺軍團菌胞內(nèi)生存和宿主細胞正常生理過程都至關(guān)重要的經(jīng)典泛素化通路。
圖2. LnaB和MavL催化形成的級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)了對非經(jīng)典泛素化過程的逆轉(zhuǎn)
該研究進一步發(fā)現(xiàn)LnaB能夠抑制酵母生長，由于PRR42-Ub是由SidE家族效應(yīng)蛋白產(chǎn)生，不是酵母本身存在的蛋白，說明LnaB在細胞內(nèi)可能存在其他底物。不僅如此，過表達LnaB實驗在293T細胞產(chǎn)生了大量的單磷酸腺苷酸化修飾信號。由于LnaB作用于PRR42-Ub的磷酸核糖基的磷?；柞；鶑V泛存在于所有磷酸化蛋白上，說明LnaB可能修飾磷酸化蛋白。
隨后實驗發(fā)現(xiàn)，過表達持續(xù)激活形式的酪氨酸激酶NPM-ALK或者加入磷酸酶抑制劑岡田酸處理后，都會顯著增加LnaB催化AMPylation的水平。利用質(zhì)譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)LnaB能夠?qū)辛姿峄z氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸殘基的多肽類底物，進行磷酰基單磷酸腺苷酸化，進而產(chǎn)生特殊的ADPylation修飾（圖3）。
圖3. LnaB對磷酸化多肽催化腺苷酸化并產(chǎn)生ADPylation修飾
該研究發(fā)現(xiàn)在感染過程中，LnaB對宿主細胞內(nèi)至關(guān)重要的Src家族激酶的活化環(huán)（activation loop）上保守磷酸化酪氨酸殘基進行磷?；鶈瘟姿嵯佘账峄?。修飾后的Src家族激酶喪失了活性，抑制了下游磷酸化信號轉(zhuǎn)導，從而抑制了其介導免疫信號通路。LnaB也是迄今為止唯一鑒定出的可以直接修飾Src家族激酶活化環(huán)上磷酸化酪氨酸殘基的細菌毒力因子。
該研究隨后通過同源搜索，鑒定出了162個LnaB同源蛋白，它們廣泛分布于20多個不同菌屬中，構(gòu)成一類新型的磷?；鶈瘟姿嵯佘栈讣易濉Ｔ摷易宄蓡T具有兩個保守的獨特SG和H-E催化基序，與先前發(fā)現(xiàn)Fic家族的結(jié)構(gòu)不同，具有新型的折疊模式。結(jié)構(gòu)研究顯示，肌動蛋白結(jié)合到LnaB的C端，穩(wěn)定其催化結(jié)構(gòu)域中的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)，保證配體ATP的結(jié)合，從而激活LnaB的酶學活性。該家族的161個成員具有三型、四型或者六型分泌系統(tǒng)的分泌信號肽，表明它們可能作用于相應(yīng)的靶細胞，有1個成員沒有分泌信號肽，其可能作用于細菌自身。
該項研究有以下幾點重要發(fā)現(xiàn)和概念突破：
1. 發(fā)現(xiàn)了一類不同于以往的、具有獨特催化基序和結(jié)構(gòu)特征的磷?；鶈瘟姿嵯佘账峄福≒hosphoryl-AMPylase）新家族；
2. 發(fā)現(xiàn)了靶向磷酰基的腺苷酸化（AMPylation）修飾，突破了AMPylation只發(fā)生在蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的概念；
3. 發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)磷酸化信號轉(zhuǎn)導的全新方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內(nèi)不可被進一步共價修飾的傳統(tǒng)概念；
4. 定義了一種新型的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，即ADPylation修飾；
5. 揭示了病原菌利用同一效應(yīng)蛋白既保護宿主泛素通路，又抑制宿主免疫防御，達到與宿主短期共存目的，實現(xiàn)“綿里藏針”的致病策略（圖4）；
6. LnaB家族的發(fā)現(xiàn)揭示了一種病原菌保守的調(diào)節(jié)宿主信號通路的機制，為病原菌致病性和效應(yīng)蛋白的研究提供新思路。
圖4. LnaB工作機制的示意圖
這項研究鑒定出的ADPylation修飾，擴展人們對蛋白質(zhì)翻譯后修飾的認識，證明了磷酸化蛋白磷?；鶊F修飾的可行性，為蛋白質(zhì)功能和信號轉(zhuǎn)導提供新的調(diào)控機制。由于Src家族激酶在人類多種疾病中發(fā)揮重要作用，對LnaB的獨特活性進行開發(fā)，對相關(guān)疾病治療具有潛在的應(yīng)用價值。進一步研究LnaB家族效應(yīng)蛋白的功能，將開辟病原菌效應(yīng)蛋白研究的新方向。
博士生王婷、碩士生宋曉楠和博士后譚加興為本文的共同第一作者，朱永群教授、周艷研究員和劉小云研究員為本文共同通訊作者，參與研究的還有博士生冼偉、周星彤、虞銘汝、王小飛、徐艷、吳婷、苑軻軻、冉宇和楊兵教授、范高峰教授。其中劉小云研究員、冼偉和周星彤分別在質(zhì)譜分析和結(jié)構(gòu)方面做了重要貢獻，范高峰教授在磷酸化多肽和磷酸化信號轉(zhuǎn)導方面提供了熱情幫助。該研究的順利實施還要感謝清華大學江鵬、浙江大學余奕、馮新華、徐平龍、南京醫(yī)科大學季晨博、中山大學陸勇軍和普渡大學羅招慶等教授們的大力支持。該研究獲得了國家基金委、科技部重點研發(fā)專項、中組部青年拔尖人才等資助。
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