RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是一種保守的轉(zhuǎn)錄后修飾，廣泛分布在rRNA、tRNA和mRNA上。mRNA上的m5C修飾主要由NSUN2和NSUN6等甲基轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)生，并且可以被TET家族蛋白和ALKBH1進(jìn)一步氧化到hm5C，f5C和ca5C。RNA m5C修飾可以被特定的結(jié)合蛋白所識(shí)別進(jìn)而參與基因表達(dá)調(diào)控，如近年來(lái)國(guó)家生物信息中心楊運(yùn)桂團(tuán)隊(duì)在RNA m5C修飾研究中取得了系列突破性成果，報(bào)道了包括ALYREF, YBX1, YBX2和SRSF2在內(nèi)的多個(gè)結(jié)合蛋白及其調(diào)控功能，極大地推動(dòng)了對(duì)于RNA m5C修飾生物學(xué)功能的理解。
對(duì)于RNA m5C修飾功能的探究依賴(lài)于靈敏精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)。目前RNA m5C修飾檢測(cè)主要依賴(lài)于亞硫酸氫鹽測(cè)序（bisulfite sequencing，BS-seq），在BS-seq中未修飾的胞嘧啶（C）被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ?/span>U），而m5C保持不變，因此通過(guò)檢測(cè)未轉(zhuǎn)變C即可實(shí)現(xiàn)對(duì)于m5C修飾的鑒定。雖然BS-seq操作簡(jiǎn)單便捷，并且可以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率m5C修飾的定量檢測(cè)，但是其存在三個(gè)主要不足之處：1）間接檢測(cè)m5C，依賴(lài)于未修飾C的高效轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換不完全可能會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性；2）反應(yīng)條件苛刻，導(dǎo)致RNA降解，限制低起始量樣本和低豐度RNA的檢測(cè)；3）C轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>U后序列復(fù)雜度降低，影響比對(duì)準(zhǔn)確度，限制低序列復(fù)雜度RNA 上m5C的檢測(cè)。盡管一系列優(yōu)化措施如使用ACT三元堿基隨機(jī)引物提高檢測(cè)精準(zhǔn)度與靈敏度、優(yōu)化分析流程、利用無(wú)修飾RNA文庫(kù)校正和 Ultrafast BS反應(yīng)條件提高轉(zhuǎn)換效率等，顯著提升了BS-seq的檢測(cè)精準(zhǔn)度，但由于mRNA m5C修飾水平較低（中位數(shù)約為20%以下），對(duì)于依賴(lài)間接檢測(cè)的BS-seq，低復(fù)雜度序列以及低修飾比例位點(diǎn)的靈敏檢測(cè)仍是挑戰(zhàn)。雖然目前已有多種不依賴(lài)亞硫酸氫鹽的RNA m5C檢測(cè)方法被報(bào)道，但是這些方法各有局限，均無(wú)法實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組水平RNA m5C修飾單堿基分辨率無(wú)偏檢測(cè)。
2024年7月12日，浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員聯(lián)合北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院伊成器教授在Molecular Cell發(fā)表了題為Base-resolution m5C profiling across the mammalian transcriptome by bisulfite-free enzyme-assisted chemical labeling approach的研究論文，該研究開(kāi)發(fā)了一種不依賴(lài)于亞硫酸氫鹽的檢測(cè)新技術(shù)，m5C-TAC-seq（m5C detection strategy enabled by TET-assisted chemical labeling），實(shí)現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組水平m5C位點(diǎn)單堿基分辨率的精準(zhǔn)、靈敏檢測(cè)。
這項(xiàng)技術(shù)的核心原理是將酶促反應(yīng)與化學(xué)標(biāo)記相結(jié)合，利用優(yōu)化后的TET酶促反應(yīng)將RNA m5C氧化至f5C，進(jìn)一步使用疊氮茚二酮（AI）對(duì)于氧化產(chǎn)生的f5C進(jìn)行特異性標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物不僅可以產(chǎn)生C-to-T的轉(zhuǎn)變，并且還可以通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行富集，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于m5C修飾單堿基分辨率的直接檢測(cè)（圖1A）。這一直接檢測(cè)的特性使其能夠靈敏檢測(cè)修飾比例低至2.5%的位點(diǎn)（圖1B）。此外該方法還具有反應(yīng)條件溫和、不影響轉(zhuǎn)錄組堿基組成的特點(diǎn)，因此可以應(yīng)用于低豐度和低序列復(fù)雜度的轉(zhuǎn)錄本。同時(shí)，結(jié)合multiplexing文庫(kù)構(gòu)建策略，不僅可以減少樣品之間的技術(shù)誤差，并且能夠?qū)崿F(xiàn)m5C修飾的半定量檢測(cè)。
圖1：m5C-TAC-seq可以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率m5C位點(diǎn)檢測(cè)。A. m5C-TAC-seq原理及流程圖；B. m5C-TAC-seq計(jì)算的C-to-T轉(zhuǎn)化率與m5C修飾比例呈現(xiàn)正相關(guān)；C. m5C-TAC-seq可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于rRNA已知位點(diǎn)與未知位點(diǎn)的靈敏檢測(cè)；D. 未修飾HeLa轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)對(duì)照分析提示2,499個(gè)m5C位點(diǎn)中只有6個(gè)位假陽(yáng)性位點(diǎn)；E. 四元堿基組成大大提高了比對(duì)準(zhǔn)確度；F. caRNA上m5C修飾位點(diǎn)分布。
為了評(píng)估m5C-TAC-seq的靈敏性和準(zhǔn)確性，研究人員首先將其應(yīng)用于rRNA和tRNA上。在rRNA上，m5C-TAC-seq不僅能夠精準(zhǔn)檢測(cè)已知的高m5C修飾位點(diǎn)，并且還鑒定了一個(gè)新的低修飾位點(diǎn)m5C3683及其修飾酶（圖1C），驗(yàn)證了m5C-TAC-seq的靈敏度。此外，對(duì)于具有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)且序列復(fù)雜度較低的tRNA，m5C-TAC-seq不僅能夠鑒定所有已報(bào)道位點(diǎn)及其修飾酶，并且由于保留了四元堿基組成使得其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同tRNA isodecoder的精準(zhǔn)檢測(cè)。利用m5C-TAC-seq，研究人員繪制了HeLa、HEK293T和mESC的單堿基分辨率m5C修飾圖譜，分別鑒定了2499、765和664個(gè)m5C位點(diǎn)，并利用無(wú)修飾轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行對(duì)照分析驗(yàn)證了這些位點(diǎn)的可靠性（圖1D）。更為重要的是，鑒定了絕大多數(shù)m5C位點(diǎn)的甲基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)一步確認(rèn)了這些位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。此外，與BS-seq相比，m5C-TAC-seq在低修飾位點(diǎn)的檢測(cè)上也表現(xiàn)出高精度和高靈敏度，提示其直接檢測(cè)策略的魯棒性。
進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，除了已知的NSUN2和NSUN6，rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN5也可以作用于mRNA，這一發(fā)現(xiàn)與近期中山大學(xué)張銳團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的高靈敏motif分析工具iMVP在mRNA上鑒定到的NSUN5 motif一致【10】。此外，利用m5C-TAC-seq，研究人員還發(fā)現(xiàn)在mESC的分化過(guò)程中，大部分mRNA上m5C位點(diǎn)呈現(xiàn)甲基化水平下調(diào)趨勢(shì)，并且富集在細(xì)胞周期及細(xì)胞分裂相關(guān)通路的轉(zhuǎn)錄本上，提示了m5C修飾可能參與到mESC分化過(guò)程中。得益于溫和的反應(yīng)條件及對(duì)堿基組成的保留（圖1E），m5C-TAC-seq實(shí)現(xiàn)了對(duì)含有大量低復(fù)雜度序列的chromatin-associated RNA（caRNA）上m5C位點(diǎn)的鑒定（圖1F），提示了四元堿基的保留對(duì)于低復(fù)雜度序列上m5C修飾檢測(cè)的重要性。
綜上所述，該研究開(kāi)發(fā)了直接檢測(cè)m5C修飾的新技術(shù)m5C-TAC-seq，并展示了m5C-TAC-seq技術(shù)高靈敏、高精準(zhǔn)的檢測(cè)特性。m5C-TAC-seq不僅可以應(yīng)用于包括低豐度、低序列復(fù)雜度在內(nèi)的多種類(lèi)型RNA和低修飾比例m5C位點(diǎn)的檢測(cè)，并且可以實(shí)現(xiàn)在多種生物學(xué)過(guò)程中m5C修飾的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，將有助于理解和推動(dòng)RNA m5C修飾生物學(xué)功能的探究。
圖2：m5C-TAC-seq可以應(yīng)用于多種類(lèi)型RNA以及生物學(xué)過(guò)程中m5C修飾位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)檢測(cè)。
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生盧亮、北京大學(xué)生科院張曉婷博士、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院周悅南博士和施佐堃博士為共同第一作者。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員和北京大學(xué)伊成器教授為本論文的共同通訊作者。浙江大學(xué)王青青教授、尹亞飛研究員、熊旭深研究員和馮鈺研究員，中山大學(xué)楊建華教授，國(guó)家生物信息中心楊瑩研究員和山東大學(xué)孫磊研究員對(duì)本研究提供了重要的幫助和討論支持。
浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院李笑雨研究員主要研究方向?yàn)?/span>RNA修飾檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)及小非編碼RNA上修飾功能的探究，常年招收博士后和科研助理，歡迎有興趣的同學(xué)投遞簡(jiǎn)歷，課題組主頁(yè)：https://person.zju.edu.cn/lixiaoyu
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.06.021
