2024年8月23日，生研院朱永群教授實驗室和生科院周艷研究員實驗室聯(lián)合在Cell Research雜志在線發(fā)表了題為“Structural basis of the bacterial flagellar motor rotational switching”的研究論文，通過構(gòu)建激活型趨化因子蛋白CheY突變體，純化來源于病原菌沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）的內(nèi)源性的、含方向開關(guān)復(fù)合物胞質(zhì)環(huán)（C ring）的鞭毛馬達顆粒，解析了分別處于逆時針和順時針旋轉(zhuǎn)方向中的、完整的鞭毛馬達-接頭裝置復(fù)合物的兩個高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，清晰地揭示了CheY蛋白結(jié)合導(dǎo)致方向開關(guān)復(fù)合物的構(gòu)象變化，提出了鞭毛馬達定子單元的內(nèi)膜重定位概念，從而闡明了細菌鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)換的分子機制，糾正了之前所有關(guān)于C ring的組裝和結(jié)構(gòu)的錯誤理解，向人們展示了完整的細菌鞭毛馬達的結(jié)構(gòu)及工作原理。
細菌鞭毛基本結(jié)構(gòu)包括鞭毛絲（filament）、接頭裝置（hook）以及鞭毛馬達（flagellar motor）三部分。鞭毛馬達是由鑲嵌在細菌細胞膜上的轉(zhuǎn)子（rotor）及其周圍錨定的定子單元（stator units）組合而成。定子單元是一種離子通道，可以利用細菌細胞膜內(nèi)外的離子電化學(xué)梯度即離子動力勢促使定子單元發(fā)生旋轉(zhuǎn)，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機械能來產(chǎn)生扭矩，扭矩經(jīng)轉(zhuǎn)子結(jié)構(gòu)中位于胞質(zhì)一側(cè)的胞質(zhì)環(huán)（cytoplasmic ring，C ring）傳遞到聯(lián)動桿，再進而傳遞給接頭裝置和遠端鞭毛絲，從而驅(qū)動細菌運動。
細菌鞭毛馬達是一個巨大的能雙向旋轉(zhuǎn)的分子馬達，通賦予了細菌超級運動能力，能驅(qū)使細菌每秒鐘游動長達自己身長幾十倍、甚至上百倍的距離。不僅如此，細菌鞭毛馬達能在逆時針和順時針旋轉(zhuǎn)方向之間進行轉(zhuǎn)換。正常情況下鞭毛逆時針旋轉(zhuǎn)，細菌向前游動。當趨化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中CheY蛋白會被磷酸化，磷酸化的CheY（CheY-P）通過結(jié)合到C ring，促使鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)方向從逆時針（CCW）轉(zhuǎn)換為順時針（CW）方向，最終改變菌體運動方向，因此C ring也被稱為方向開關(guān)復(fù)合物（switch complex）。此外，CheZ可以將CheY-P去磷酸化進而反調(diào)控馬達的旋轉(zhuǎn)方向。由于C ring結(jié)構(gòu)高度動態(tài)且在內(nèi)源性純化時容易從鞭毛馬達上解聚，因此聚焦于C ring的鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)方向調(diào)控的結(jié)構(gòu)機制研究一直存在不少的障礙，導(dǎo)致細菌鞭毛馬達旋轉(zhuǎn)方向轉(zhuǎn)換的分子機制長期不清楚，是領(lǐng)域內(nèi)長期懸而未決的重要問題之一。
浙江大學(xué)朱永群課題組近年來一直研究細菌鞭毛馬達工作機制，不斷優(yōu)化沙門氏菌內(nèi)源性鞭毛馬達純化體系，通過構(gòu)建激活型CheY突變體（CheY**，即CheYD13K&Y106W突變體），成功獲得了逆時針和順時針旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下沙門氏菌含C ring的完整鞭毛馬達-接頭裝置復(fù)合物顆粒，并解析了它們的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖1）。含CCW-C ring的鞭毛馬達-接頭裝置復(fù)合物結(jié)構(gòu)共包含341個亞基，由15種不同鞭毛蛋白組成，整體分子量約為10.2MDa，高度約為680?。而含CheY**結(jié)合的CW-C ring的鞭毛馬達-接頭裝置復(fù)合物整個模型由375個亞基組成，高度約為664?。兩種旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下的C ring均具有C34對稱性，由34個FliG、34個FliM和102個FliN以1:1:3的摩爾比例組成，內(nèi)部具有廣泛且獨特的亞基間的交叉互作，可分為內(nèi)部亞環(huán)、上部亞環(huán)、中間亞環(huán)和底部亞環(huán)共計四個亞環(huán)。其中，FliG通過堆積致其C端結(jié)構(gòu)域FliGCC排列形成了可以與定子單元互作的上部亞環(huán)結(jié)構(gòu)。CheY**的結(jié)合導(dǎo)致了C ring的整體結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的傾斜和向內(nèi)收縮，并向MS ring和細菌內(nèi)膜靠近16 ?的距離（圖1）。
圖1. 含方向開關(guān)復(fù)合物的細菌鞭毛馬達在逆時針和順時針旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下的冷凍電鏡電子密度和三維結(jié)構(gòu)。
激活型CheY通過FliM的N端結(jié)構(gòu)域結(jié)合在相鄰FliMM及FliGM結(jié)構(gòu)域外表面形成的間隙中，導(dǎo)致C ring的各結(jié)構(gòu)單元均出現(xiàn)不同程度的構(gòu)象變化，特別是FliG亞基的構(gòu)象發(fā)生了巨大變化（圖2）。CheY的結(jié)合改變了FliG亞基所有結(jié)構(gòu)域的空間位置和結(jié)構(gòu)域間的相對距離，進而導(dǎo)致FliGCC結(jié)構(gòu)域發(fā)生了180°旋轉(zhuǎn)并向馬達中心移動了10 ?的距離，促使與定子單元互作的FliGCC結(jié)構(gòu)域的核心螺旋結(jié)構(gòu)αtorque出現(xiàn)取向和靜電勢能分布的翻轉(zhuǎn)。C ring 的構(gòu)象變化說明定子單元須向馬達中心移動，需要在細菌內(nèi)膜上發(fā)生重新定位，以適應(yīng)αtorque空間位置的變化。通過分析以往報道過的冷凍斷層掃描數(shù)據(jù)，結(jié)合建立含定子單元的完整鞭毛馬達結(jié)構(gòu)模型（圖3），證明了定子單元確實在細菌內(nèi)膜上發(fā)生重新定位。
圖2. 激活型CheY結(jié)合導(dǎo)致C ring發(fā)生構(gòu)象變化。
以上數(shù)據(jù)分析展示了鞭毛馬達方向轉(zhuǎn)換的分子機制：在無CheY蛋白結(jié)合時，沿順時針方向旋轉(zhuǎn)的定子單元位于C ring的FliGCC亞環(huán)的外側(cè)，驅(qū)動鞭毛馬達沿逆時針方向旋轉(zhuǎn)。當CheY結(jié)合到C ring時，促進C ring 發(fā)生構(gòu)象變化，向鞭毛馬達中心收縮并整體上移，進而引起FliGCC結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，最終導(dǎo)致FliGCC上的αtorque發(fā)生了180°的翻轉(zhuǎn)，進而實現(xiàn)定子單元從FliG外側(cè)轉(zhuǎn)到內(nèi)側(cè)，在內(nèi)膜上發(fā)生空間重定位，促使C ring以順時針方向進行旋轉(zhuǎn)，從而實現(xiàn)鞭毛馬達方向的轉(zhuǎn)換（圖3）。
圖3. 細菌鞭毛馬達方向轉(zhuǎn)換的機制模式圖。
這項研究工作糾正了之前所有關(guān)于C ring的組裝和結(jié)構(gòu)的錯誤理解，改變了之前認為定子是完全固定在細菌內(nèi)膜上的概念，反駁了以往所有的關(guān)于鞭毛馬達方向轉(zhuǎn)換是因為C ring的結(jié)構(gòu)外延這一假說，并向人們展示了完整鞭毛馬達三維結(jié)構(gòu)和工作機制，為設(shè)計新抗菌藥物以及新型旋轉(zhuǎn)納米機器人奠定了理論基礎(chǔ)。
朱永群教授和周艷研究員是本文的通訊作者，譚加興博士和張玲博士為本文的共同第一作者，參加研究的還有研究生周星彤和韓似玉等。浙江大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院精準醫(yī)學(xué)研究所等單位的冷凍電鏡中心參與電鏡數(shù)據(jù)的收集工作。本研究由國家自然科學(xué)基金（U23A20163和81925024）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFA0503900）和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費的資助。
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41422-024-01017-z
