2024年8月23日，生研院朱永群教授實驗室和生科院周艷研究員實驗室聯(lián)合在Cell Research雜志在線發(fā)表了題為“Structural basis of the bacterial flagellar motor rotational switching”的研究論文，通過構建激活型趨化因子蛋白CheY突變體，純化來源于病原菌沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）的內源性的、含方向開關復合物胞質環(huán)（C ring）的鞭毛馬達顆粒，解析了分別處于逆時針和順時針旋轉方向中的、完整的鞭毛馬達-接頭裝置復合物的兩個高分辨率冷凍電鏡結構，清晰地揭示了CheY蛋白結合導致方向開關復合物的構象變化，提出了鞭毛馬達定子單元的內膜重定位概念，從而闡明了細菌鞭毛馬達旋轉方向轉換的分子機制，糾正了之前所有關于C ring的組裝和結構的錯誤理解，向人們展示了完整的細菌鞭毛馬達的結構及工作原理。
細菌鞭毛基本結構包括鞭毛絲（filament）、接頭裝置（hook）以及鞭毛馬達（flagellar motor）三部分。鞭毛馬達是由鑲嵌在細菌細胞膜上的轉子（rotor）及其周圍錨定的定子單元（stator units）組合而成。定子單元是一種離子通道，可以利用細菌細胞膜內外的離子電化學梯度即離子動力勢促使定子單元發(fā)生旋轉，將化學能轉化為機械能來產(chǎn)生扭矩，扭矩經(jīng)轉子結構中位于胞質一側的胞質環(huán)（cytoplasmic ring，C ring）傳遞到聯(lián)動桿，再進而傳遞給接頭裝置和遠端鞭毛絲，從而驅動細菌運動。
細菌鞭毛馬達是一個巨大的能雙向旋轉的分子馬達，通賦予了細菌超級運動能力，能驅使細菌每秒鐘游動長達自己身長幾十倍、甚至上百倍的距離。不僅如此，細菌鞭毛馬達能在逆時針和順時針旋轉方向之間進行轉換。正常情況下鞭毛逆時針旋轉，細菌向前游動。當趨化信號轉導通路中CheY蛋白會被磷酸化，磷酸化的CheY（CheY-P）通過結合到C ring，促使鞭毛馬達旋轉方向從逆時針（CCW）轉換為順時針（CW）方向，最終改變菌體運動方向，因此C ring也被稱為方向開關復合物（switch complex）。此外，CheZ可以將CheY-P去磷酸化進而反調控馬達的旋轉方向。由于C ring結構高度動態(tài)且在內源性純化時容易從鞭毛馬達上解聚，因此聚焦于C ring的鞭毛馬達旋轉方向調控的結構機制研究一直存在不少的障礙，導致細菌鞭毛馬達旋轉方向轉換的分子機制長期不清楚，是領域內長期懸而未決的重要問題之一。
浙江大學朱永群課題組近年來一直研究細菌鞭毛馬達工作機制，不斷優(yōu)化沙門氏菌內源性鞭毛馬達純化體系，通過構建激活型CheY突變體（CheY**，即CheYD13K&Y106W突變體），成功獲得了逆時針和順時針旋轉狀態(tài)下沙門氏菌含C ring的完整鞭毛馬達-接頭裝置復合物顆粒，并解析了它們的冷凍電鏡結構（圖1）。含CCW-C ring的鞭毛馬達-接頭裝置復合物結構共包含341個亞基，由15種不同鞭毛蛋白組成，整體分子量約為10.2MDa，高度約為680?。而含CheY**結合的CW-C ring的鞭毛馬達-接頭裝置復合物整個模型由375個亞基組成，高度約為664?。兩種旋轉狀態(tài)下的C ring均具有C34對稱性，由34個FliG、34個FliM和102個FliN以1:1:3的摩爾比例組成，內部具有廣泛且獨特的亞基間的交叉互作，可分為內部亞環(huán)、上部亞環(huán)、中間亞環(huán)和底部亞環(huán)共計四個亞環(huán)。其中，FliG通過堆積致其C端結構域FliGCC排列形成了可以與定子單元互作的上部亞環(huán)結構。CheY**的結合導致了C ring的整體結構發(fā)生了明顯的傾斜和向內收縮，并向MS ring和細菌內膜靠近16 ?的距離（圖1）。
圖1. 含方向開關復合物的細菌鞭毛馬達在逆時針和順時針旋轉狀態(tài)下的冷凍電鏡電子密度和三維結構
激活型CheY通過FliM的N端結構域結合在相鄰FliMM及FliGM結構域外表面形成的間隙中，導致C ring的各結構單元均出現(xiàn)不同程度的構象變化，特別是FliG亞基的構象發(fā)生了巨大變化（圖2）。CheY的結合改變了FliG亞基所有結構域的空間位置和結構域間的相對距離，進而導致FliGCC結構域發(fā)生了180°旋轉并向馬達中心移動了10 ?的距離，促使與定子單元互作的FliGCC結構域的核心螺旋結構αtorque出現(xiàn)取向和靜電勢能分布的翻轉。C ring 的構象變化說明定子單元須向馬達中心移動，需要在細菌內膜上發(fā)生重新定位，以適應αtorque空間位置的變化。通過分析以往報道過的冷凍斷層掃描數(shù)據(jù)，結合建立含定子單元的完整鞭毛馬達結構模型（圖3），證明了定子單元確實在細菌內膜上發(fā)生重新定位。
圖2. 激活型CheY結合導致C ring發(fā)生構象變化
以上數(shù)據(jù)分析展示了鞭毛馬達方向轉換的分子機制：在無CheY蛋白結合時，沿順時針方向旋轉的定子單元位于C ring的FliGCC亞環(huán)的外側，驅動鞭毛馬達沿逆時針方向旋轉。當CheY結合到C ring時，促進C ring 發(fā)生構象變化，向鞭毛馬達中心收縮并整體上移，進而引起FliGCC結構域構象變化，最終導致FliGCC上的αtorque發(fā)生了180°的翻轉，進而實現(xiàn)定子單元從FliG外側轉到內側，在內膜上發(fā)生空間重定位，促使C ring以順時針方向進行旋轉，從而實現(xiàn)鞭毛馬達方向的轉換（圖3）。
圖3. 細菌鞭毛馬達方向轉換的機制模式圖
這項研究工作糾正了之前所有關于C ring的組裝和結構的錯誤理解，改變了之前認為定子是完全固定在細菌內膜上的概念，反駁了以往所有的關于鞭毛馬達方向轉換是因為C ring的結構外延這一假說，并向人們展示了完整鞭毛馬達三維結構和工作機制，為設計新抗菌藥物以及新型旋轉納米機器人奠定了理論基礎。
朱永群教授和周艷研究員是本文的通訊作者，譚加興博士和張玲博士為本文的共同第一作者，參加研究的還有研究生周星彤和韓似玉等。浙江大學、復旦大學、上海交通大學醫(yī)學院精準醫(yī)學研究所等單位的冷凍電鏡中心參與電鏡數(shù)據(jù)的收集工作。本研究由國家自然科學基金（U23A20163和81925024）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFA0503900）和中央高?；究蒲袠I(yè)務費的資助。
