成熟的卵母細胞（oocyte）是哺乳動物體內最大的細胞類型。與體細胞（somatic cell）有限的體積增長不同，卵母細胞從原始卵泡激活發(fā)育到生長完成，體積增長近500倍。但卵母細胞如何生長成為最大的細胞，還存在諸多未解之謎。卵巢中儲存的原始卵泡激活以后，卵泡中的卵母細胞要經(jīng)歷為期數(shù)周的生長期，伴隨著持續(xù)活躍的轉錄和轉錄后加工、核質運輸?shù)然顒樱⒃诼寻|中積累了大量轉錄加工成熟的mRNA，為后續(xù)轉錄沉默的減數(shù)分裂、排卵和受精時期提供重要的物質基礎[1,2]。但卵母細胞如何確保這一過程中RNA的正確加工與儲存，及其對卵母細胞發(fā)育潛能的影響還尚未清晰。
近日，浙江大學生命科學研究院、浙江大學紹興研究院范衡宇團隊在Developmental Cell發(fā)表題為“RNA Surveillance by the RNA Helicase MTR4 Determines Volume of Mouse Oocytes”的研究論文，報道了RNA解旋酶MTR4參與的RNA外切體復合物（RNA exosome）作為一種RNA監(jiān)管機制，是卵母細胞生長過程中的一個關鍵檢查點，允許卵母細胞生長到巨大的體積，經(jīng)歷細胞核和細胞質的成熟并最終獲得發(fā)育潛能。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)了MTR4介導的RNA監(jiān)管機制對于維持卵母細胞正常核環(huán)境的新功能。
研究團隊在卵母細胞中首次使用細胞核與細胞質分離后進行轉錄組測序的方法，定量統(tǒng)計了卵母細胞在生長過程中整體mRNA水平及細胞核和細胞質這兩種亞細胞組分中mRNA分布比例的變化，并鑒定出細胞核和細胞質中轉錄物的不同剪接加工特征，提出RNA監(jiān)管機制可能在其中發(fā)揮重要功能。通過對RNA外切體復合物的前期調研，該研究采用在卵母細胞中條件性敲除Mtr4這一基因來實現(xiàn)對卵母細胞中RNA監(jiān)管機制的破壞?；诨蚯贸蟮谋硇头治龊突匮a實驗證實了MTR4缺失會給小鼠卵母細胞造成無法逆轉的嚴重的成熟障礙，包括卵母細胞體積明顯減小，無法完成卵子成熟所必須的核構象轉變、基因組轉錄沉默和減數(shù)分裂恢復。
圖1: Mtr4條件性敲除小鼠卵母細胞的表型。
A: RNA 外切體降解途徑的不同復合物中主要成分的示意圖。B: 從Mtr4fl/fl和Mtr4fl/fl;Zp3-Cre小鼠卵巢中收集的卵母細胞的代表性圖像。C:卵母細胞直徑統(tǒng)計。
通過熒光原位雜交實驗和核質分離測序等實驗，該研究證明了MTR4缺失后RNA監(jiān)管機制失效，導致大量未成熟RNA滯留在細胞核中，與此同時細胞質中的成熟mRNA儲量也大幅下降。生信分析表明，MTR4缺失后核中滯留的轉錄本多為加工不完全的廢物RNA，部分內含子異常保留的轉錄本甚至被進一步運輸?shù)桨|中。通過在 Mtr4 敲除的卵母細胞中顯微注射回補MTR4，檢測到異常累積的轉錄本含量明顯減少，證實了MTR4介導的RNA 監(jiān)管機制在監(jiān)管RNA質量和維持RNA正常的核質分布比例中發(fā)揮直接作用。
圖2: MTR4 缺失導致細胞核內mRNA的累積和細胞質mRNA減少。
A: 卵母細胞的核質分離測序的收樣時間點及所使用測序方法的示意圖。B: Poly(A) RNA-seq中Mtr4fl/fl和Mtr4-null卵母細胞的細胞核-細胞質的相對 mRNA 拷貝數(shù)及對應的細胞質/細胞核的比值。C-D: 核質分離Poly(A) RNA-seq中的轉錄本表達水平的散點圖。E-F: FISH檢測poly(A) RNA信號。
Mtr4 敲除小鼠卵母細胞RNA 監(jiān)管機制失效后，卵母細胞發(fā)育過程中核構象由NSN向SN轉變失敗。通過進一步的表型鑒定及染色質開放性分析（ATAC-seq），發(fā)現(xiàn)核中異常累積的RNA造成了染色質開放程度增加，染色質無法正常凝集并轉錄沉默；CUT&Tag測序分析也揭示了與轉錄密切相關的組蛋白修飾H3K4me3在染色質上分布異常。除影響染色質結構外，核中異常累積的RNA還造成了細胞核區(qū)室化結構的異常，包括核斑點和核仁無法正常組裝。以上實驗結果揭示了MTR4 介導的RNA 監(jiān)管機制在維持卵母細胞健康的核環(huán)境及促進細胞核成熟方面的重要功能，也進一步發(fā)現(xiàn)RNA穩(wěn)態(tài)負反饋調節(jié)染色質構象、組蛋白修飾建立和核內區(qū)室化結構的形成。
圖3: RNA監(jiān)管機制失效后卵母細胞的細胞核環(huán)境紊亂。
A: MTR4缺失后卵母細胞核構象由NSN向SN轉變失敗。B: MTR4缺失后卵母細胞無法轉錄沉默。C: MTR4缺失后PABPN1介導的NPAD結構和nuclear speckles無法正常形成。
此外，該研究還提出RNA 監(jiān)管機制通過以下兩個方面影響卵母細胞的生長和胞質成熟。（1）維持健康的核環(huán)境，保證了卵母細胞生長過程中的轉錄及轉錄后加工活動，在胞質中累積足量的正常轉錄本。（2）保證了核仁正常的組裝與功能，為細胞質的蛋白翻譯提供核糖體機器。綜上，MTR4介導的RNA監(jiān)管機制確保了細胞核和細胞質中豐富的mRNA積累和有序儲存，對于決定卵母細胞的體積和發(fā)育潛能具有重要生理意義。
圖4: RNA監(jiān)管機制確保小鼠卵母細胞生長成熟的模式圖
該課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)，Poly(A)結合蛋白PABPN1具有對新生RNA進行剪切、加尾、保護和儲存的重要功能[3]。PABPN1通過介導液-液相分離形成細胞核內的特定功能區(qū)域nuclear poly(A) domain (NPAD)，調控卵子發(fā)生過程中mRNA的轉錄后加工。MTR4和PABPN1同屬于RNA外切體復合物，兩者的敲除小鼠卵母細胞在分子水平上均存在RNA加工異常、不能有效建立起母源mRNA儲備等問題，并具有卵母細胞體積減小、發(fā)育成熟障礙等相似的表型。這一系列研究揭示了卵母細胞生長過程中的mRNA轉錄后加工調控和監(jiān)管對于建立卵母細胞發(fā)育潛能的重要作用，為解析卵母細胞如何生長成為體內最大的細胞提供了新的理論。
浙江大學生命科學研究院范衡宇教授團隊的博士生吳韻雯（已畢業(yè)）為本文第一作者。本研究受國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金、國家萬人計劃、浙江省自然科學基金項目和浙江省重點研發(fā)計劃等項目資助。中科院分子細胞科學卓越中心程紅教授課題組也對本研究提供了大力支持。
文章鏈接見：
https://www.cell.com/developmental-cell/abstract/S1534-5807(24)00537-9
